Образование
Сын священника московской Успенской на Малой Дмитровке церкви. Окончил Законоспасское духовное училище, Московскую духовную семинарию в 1908, Московскую духовную академию (1912) со степенью кандидата богословия. Магистр богословия (1914; тема диссертации: «Книга пророка Аввакума. Введение в толкование»).
Монах и учёный
10 июня 1911 года был пострижен в монашество, с 23 июня 1911 — иеродиакон, с 18 февраля 1912 года — иеромонах.
С 1912 года — и. д. доцента кафедры Священного Писания Ветхого Завета Московской духовной академии.
С 1913 года — благочинный академического Покровского храма.
С 1914 года — доцент. С 20 августа 1916 — экстраординарный профессор.
С 1919 — настоятель академического Покровского храма. Архимандрит.
В 1920 Патриарх Тихон назначил его директором Высшего богословского института.
В 1920 выступил с проповедью против вскрытия мощей преп. Сергия Радонежского. 6 сентября 1920 был за это арестован, 28 февраля 1921 освобождён по состоянию здоровья (из тюрьмы его вынесли на носилках).
Магистерская диссертация владыки Варфоломея основана на детальном анализе греческого и еврейского текстов пророка Аввакума с учётом славянских рукописей. Труд свидетельствует о глубокой эрудиции и разностороннем подходе к теме. Автор сосредоточил своё внимание на текстуальной критике и «историческом истолковании книги пророка Аввакума». Однако более, чем историк-библеист, был известен как знаток литургики и церковно-славянского языка. Митрополит Сергий (Страгородский) поручил ему исправлять все церковные службы, песнопения, поступающие на отзыв в Московскую Патриархию.
Православный архиерей
С 28 июля 1921 — епископ Сергиевский, викарий Московской епархии. После закрытия Троице-Сергиевой лавры, в 1923—1929 — настоятель Высокопетровского монастыря в Москве. В 1929—1935 — настоятель храма Рождества Богородицы, что в Путинках — в этот храм после закрытия монастыря перешли клирики, служившие вместе с епископом Варфоломеем, и близкие к нему прихожане. Пользовался уважением верующих как аскет, молитвенник и исповедник, имел репутацию старца. Организатор тайных монашеских общин. Оставался в юрисдикции Заместителя Патриаршего местоблюстителя митрополита Сергия (Страгородского), критически относился к его церковно-политическому курсу.
В 1928 был арестован, обвинён в «укрывательстве шпиона». Находясь в заключении, подписал обязательство сотрудничать с ОГПУ, после чего был освобождён. В качестве агента не давал чекистами информации, на которую те рассчитывали. С самого начала своего «сотрудничества» с ОГПУ выполнял обязанности агента формально, стремясь сохранить в Москве тайное монашество, «прикрыв» его от репрессий со стороны властей.
9 июня 1934 года возведён в сан архиепископа.
Тайный католик
В 1928 познакомился с апостольским администратором в Москве епископом Пием Эженом Невё, с которым затем постоянно общался (в ОГПУ считали, что епископ Варфоломей будет осведомлять чекистов о настроениях и деятельности епископа Невё). На деле рассматривал сближение с католиками как возможность для облегчения судьбы Русской церкви, передавал представителю Ватикана в России информацию о гонениях на церковь для того, чтобы довести её до международной общественности. Постепенно стал проявлять симпатии к католичеству, однако ещё в 1931 епископ Невё в одном из писем выражал сомнение в том, что владыка Варфоломей может стать католиком, так как он «ограничивается расплывчатыми словами о своих симпатиях и очень боится себя скомпрометировать». Однако уже в 1932 тайно перешёл в католичество, создал небольшую тайную католическую общину из прихожан своего храма. О своём переходе в католичество не поставил в известность чекистов.
В 1933 получил официальные документы о своих полномочиях от папской комиссии Pro Russia за подписью главы этой комиссии епископа Мишеля д’Эрбиньи. В документах говорилось об учреждении титулярной кафедры Сергиевской в юрисдикции папы римского и о поставлении на неё «уже облечённого епископским саном в восточном обряде» епископа Варфоломея в качестве викария епископа Неве. Д’Эрбиньи высоко оценивал решение владыки Варфоломея (первый такой пример в России XX века), рассматривая тайного католического епископа как будущего Патриарха восточного обряда в юрисдикции Папы.
