В 1541 г. был кравчим, в 1547 г. спальником, с 1548 г. боярином; пользовался особенным расположением Ивана Грозного. В казанском походе 1552 г. и в походе против ливонцев 1559 г. был первым воеводой. Вместе с Шуйским взял Мариенбург, покорил Феллин (1560) и долго осаждал Ревель. При учреждении опричнины Иван Мстиславский, во главе земщины, был вторым боярином после И. Д. Бельского и назывался «земским боярином». Не раз он удачно отражал вторжения крымцев, но в 1571 г. счастье ему изменило: хан Девлет I Герай сжёг и разорил Москву. Царь Иван IV обвинил Мстиславского в измене; только заступничество митрополита и духовенства спасло его от казни. В 1572 г. был новгородским наместником. Ровно через 9 лет он опять был заподозрен в каких-то «изменных винах». Тем не менее умирающий Иоанн Грозный назначил его советником верховной думы; но после воцарения Фёдора Иоанновича Борис Годунов, друживший перед тем с Иваном Мстиславским, сослал его, за участие в заговоре Шуйских и других бояр, в Кириллов монастырь, где он умер в том же 1586 г.
Его сын Фёдор Иванович, последний представитель рода — видный деятель Смутного времени.
