Будучи близкой родственницей английских королей, Маргарита воспитывалась при дворе короля Генриха VIII вместе с его старшей дочерью Марией, будущей королевой Англии Марией I Кровавой, с которой Маргарита стала очень дружна. В 1544 году Маргарита вышла замуж за шотландского эмигранта Мэтью Стюарта, графа Леннокса, который вёл своё происхождение от королей Шотландии из династии Стюартов. После восшествия на престол Англии Елизаветы I Маргарита Дуглас, сохранившая верность католической религии, была удалена от королевского двора и поселилась в Йоркшире, где стала участницей интриг английских католиков против королевы.
В 1565 году сын Маргариты и Леннокса, Генри Стюарт, лорд Дарнли, женился на королеве Шотландии Марии Стюарт. Разгневанная Елизавета заточила Маргариту Дуглас в Тауэр и освободила лишь после убийства лорда Дарнли в 1567 году. Когда второй сын Маргариты, Чарльз Стюарт, сочетался браком с Элизабет Кавендиш, она вновь оказалась в тюрьме: королева Елизавета не могла допустить, чтобы потомки Тюдоров без её согласия заключали браки, боясь появления сильного претендента на престол.
Маргарита Дуглас скончалась в 1578 году и была похоронена в Вестминстерском аббатстве вместе с королями Англии. Внук Маргариты Яков Стюарт стал королём Шотландии (с 1567 г.) и Англии (с 1603 г.).
