В молодые годы служил нотариусом в Севилье. После второго путешествия Христофора Колумба в Новый свет в 1494 году и первого путешествия Алонсо де Охеда в 1499 году, в которых Бастидас принимал непосредственное участие, он попросил короля о создании своей экспедиции и лично её профинансировал. В обмен на право исследовать новые территории испанская королевская семья потребовала ? полученного им дохода.
В октябре 1500 года Бастидас отплыл из Кадиса на двух кораблях, называвшихся San Ant?n и Santa Maria de Gracia. В этой экспедиции его сопровождали Васко Нуньес де Бальбоа и Хуан де ла Коса. По достижении берегов Южной Америки Бастидас исследовал около 1000 км побережья Карибского моря, открыл устье реки Магдалены, а также Дарьенский залив и залив Ураба. Участники экспедиции первыми исследовали внутренние области континента в районе Сьерра-Невада-де-Санта-Марта. Из-за плохого состояния кораблей, вызванного корабельными червями, был вынужден вернуться в Санто-Доминго, предварительно первым из европейцев ступив на Панамский перешеек.
За время плавания в 1502 году Бастидас нашёл много золота, но по обвинению в незаконной торговле был арестован губернатором Испаньолы Франсиском де Бобадилья и отправлен в Испанию.
Был оправдан королевской семьёй и вернулся в Новый свет, где до 1524 года разводил скот на Гаити, а затем основал город Санта-Марта на северном берегу Колумбии. В 1527 году Родриго де Бастидас был ранен взбунтовавшимися солдатами, отправился лечиться в Санто-Доминго, но умер по дороге на Кубе.
Бастидас считался самым благородным конкистадором Испании, поскольку относился к индейцам с гуманностью и уважением.
